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“青年科學(xué)家”論壇李迪：對(duì)付超級(jí)細(xì)菌，可以采取這樣的解決思路

作者：轉(zhuǎn)自：原創(chuàng)：養(yǎng)豬信息網(wǎng) 發(fā)布時(shí)間：2018-08-25 14:00:25

李迪：消除細(xì)菌耐藥基因工程噬菌體的構(gòu)建及應(yīng)用

目前嚴(yán)峻的細(xì)菌耐藥性現(xiàn)狀，世界衛(wèi)生組織發(fā)表了世界上最具耐藥性且最能威脅人類健康的"超級(jí)細(xì)菌"：

由質(zhì)粒介導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)菌耐藥：耐藥質(zhì)粒通常是細(xì)菌后天獲得的，因?yàn)閭鞑ネ緩蕉鄻踊?，這種機(jī)制介導(dǎo)的耐藥在臨床上占重要地位。如超廣譜β-內(nèi)酰胺酶就是通過(guò)耐藥質(zhì)粒在某些腸桿菌科之間垂直或種間傳播。

噬菌體的作用機(jī)制：噬菌體作為細(xì)菌的天敵，將其基因注入宿主細(xì)菌中，并利用宿主菌的核糖體、蛋白質(zhì)合成時(shí)所需的各種因子、氨基酸和能量產(chǎn)生系統(tǒng)來(lái)實(shí)現(xiàn)自身的生長(zhǎng)和增殖。

使用抗生素時(shí)，是在增加敏感細(xì)菌的耐藥性選擇性壓力?？股啬退幮栽诩?xì)菌種屬之間以各種途徑不斷積累和傳播，產(chǎn)生超級(jí)細(xì)菌。

噬菌體在畜禽細(xì)菌性疾病控制中的應(yīng)用：

1、消毒方式：在畜禽欄舍內(nèi)進(jìn)行噴灑；

2、口服飼喂：噬菌體雞尾酒試劑；

3、口服飼喂：微囊化的噬菌體制劑；

4、皮下或者肌肉注射。

我們前期研究工作主要是應(yīng)用烈性噬菌體及其裂解酶直接殺滅耐藥細(xì)菌，減少耐藥細(xì)菌；本項(xiàng)目從消除耐藥基因的角度進(jìn)行研究，構(gòu)建攜帶基因編輯系統(tǒng)的溫和噬菌體對(duì)野生型耐藥菌耐藥基因進(jìn)行定向的剪切與消除，從而恢復(fù)耐藥菌對(duì)抗生素的敏感性，具有良好的應(yīng)用價(jià)值及社會(huì)意義。本項(xiàng)目同時(shí)為消除超級(jí)細(xì)菌的多重耐藥性提供了解決思路。

研究進(jìn)展及可行性評(píng)估：

本試驗(yàn)采用的BAC+RedET修飾系統(tǒng)因基于大腸桿菌的重組蛋白RecE和RecT，能高效的介導(dǎo)線性DNA分子發(fā)生同源重組，形成一個(gè)環(huán)狀的DNA分子，從而可在短時(shí)間內(nèi)將50kb左右的DNA片段直接克隆至表達(dá)載體上，從理論上來(lái)講該技術(shù)可適用于將CRISPR-Cas系統(tǒng)及耐藥基因整合至溶源性噬菌體上，從而完成工程噬菌體的構(gòu)造。

目前已成功從野生型耐藥菌中誘導(dǎo)出溶源性噬菌體，完成了該噬菌體的純化及部分生物學(xué)特性的驗(yàn)證，已測(cè)序并分析全基因序列，并設(shè)計(jì)合成含同源臂的BR322-amp-ccdB pcr引物，為后期工程噬菌體的構(gòu)建打下了充分的基礎(chǔ)。

研究創(chuàng)新性：

一. 已有研究人員通過(guò)物理法（電穿孔法、高溫培養(yǎng)、紫外線法等）和化學(xué)法（SDS 法、抗生素法、中藥法等）兩類方法來(lái)消除細(xì)菌耐藥質(zhì)粒進(jìn)而逆轉(zhuǎn)其耐藥性，但是利用生物學(xué)方法消除細(xì)菌耐藥性的相關(guān)研究并不多見(jiàn)。所以本實(shí)驗(yàn)中利用構(gòu)造工程噬菌體以生物學(xué)方法來(lái)消除細(xì)菌耐藥性對(duì)于細(xì)菌耐藥性的研究具有一定的創(chuàng)新性意義。

二. 本項(xiàng)目利用BAC+RedET修飾系統(tǒng)將溶源性噬菌體與CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行連接進(jìn)而構(gòu)造工程噬菌體，在技術(shù)上具有良好的創(chuàng)新性。該技術(shù)是山東大學(xué)張友明教授團(tuán)隊(duì)的專利產(chǎn)品，是目前國(guó)際上最高效的大片段基因編輯重組技術(shù)，我們與他們合作開(kāi)展本項(xiàng)目。